HomeĐời SốngWestern blot là gì

Western blot là gì

23:33, 30/03/2021
Xét nghiệm sinh hóaXét nghiệm máu họcXét nghiệm đông máu - miễn dịchXét nghiệm nước tiểu - vi sinhXét nghiệm DT & SHPT
*

*

*

*

*

Nhóm thứ làm cho lạnhNhóm thiết bị có tác dụng nóngNhóm vật dụng cơ họcNội thất Phòng thí nghiệmCân/pH/Lọc/Pipet/Bơm...

Bạn đang xem: Western blot là gì


Hóa chất cơ bản/phân tíchHóa chất sinc họcSinch phẩm xét nghiệmPipet/Vật tứ tiêu haoHóa hóa học sinh học tập phân tử
Các nghệ thuật phân tíchCác kỹ thuật lấy mẫuPhân một số loại môi trườngCác dự án công trình môi trường xung quanh - Chuyển giao công nghệMôi ngôi trường với cuộc sống
aiesec-unwe.net

*

nguồn ảnh: http://proteomics.case.edu/proteomics/westernblot.html

Pmùi hương phápWestern blot(tuyệt còn được gọi làprotein immunoblot) là mộtchuyên môn phân tíchđược thực hiện thoáng rộng nhằm phát hiện nay cácproteinssiêng biệt bên trên những chủng loại mô giỏi dịch chiết xuất tế bào. Pmùi hương pháp này sử dụngđiện di bên trên gelnhằm phân tách bóc những protein còn nguim vẹn bằng kết cấu 3-D xuất xắc protein đang trở nên tính theo độ lâu năm của mạch polypeptide. Protein này tiếp đến sẽ được chuyển lên màng (thường thực hiện là màngnitrocellulosetuyệt màngPVDF), nghỉ ngơi đó chúng được đính bằng cácchống thểsệt hiệu với protein đích.Điện di bên trên gel được đưa vào hệ thống so với Western Blot nhằm mục đích giải quyết vụ việc củacác bội phản ứng chéothân các kháng thể.

hầu hết chủ thể chất hóa học chuyên cung cấp những phòng thể (cả phòng thểsolo dòngvà chống thểnhiều dòng) khớp ứng vời hàng vạn protein khác biệt.Các kháng thể thương thơm mại thường sẽ có giá cả cao, tuy nhiên chống thể ko links có thể tái áp dụng giữa các thể nghiệm. Phương thơm pháp này được áp dụng những trong những nghành củasinh học tập phân tử,miễn kháng genvới các ngành sinch học phân tử khác. Một số phép tắc tìm kiếm tìm, nlỗi làCiteAb, Antibodypedia, và SeekProducts, có thể được thực hiện sẽ giúp những đơn vị phân tích tìm tìm đều phòng thể thích hợp để áp dụng trong cách thức Western Blot.

Những phương pháp tương quan khác bao gồm phương thức lai phân tử (dot blot),hóa tế bào miễn dịchvàhóa tế bào miễn kháng, ngơi nghỉ kia những chống thể được thực hiện để vạc hiện nay các protein trên mô với tế bào bằng cáchnhuộm miễn dịch, với dung nạp miễn kháng lên link enzyme (ELISA).

Các bước thực hiện

Chuẩn bị mô

Nên mang mẫu mã từ bỏ toàn bộ mô xuất xắc canh ngôi trường (môi trường xung quanh nuôi cấy) tế bào. Trước tiên, cách xử lý mô rắn bởi phương pháp cơ học tập nhỏng sử dụnglắp thêm nghiền(khi lượng mẫu lớn), sử dụngđồ vật đồng hóa(vật dụng ép đồng thể) hoặchết sức âm(với số lượng mẫu nhỏ). Cũng có thể phá hủy tế bào bởi một trong những phương pháp chất hóa học nhỏng bên trên. Tuy nhiên, phần nhiều mẫu vi khuẩn xuất xắc chủng loại rước trường đoản cú môi trường xung quanh cũng rất có thể là nguồn protein xác định được vào Western Blot, ko sẽ phải là phân tích tế bào.

cũng có thể sử dụng những loạihóa học tẩy cọ, muối bột, vàđệmnhằm thúc đẩy ly giải tế bào cùng tổ hợp protein.Thường bổ sung những chất giam giữ proteasevàphosphataseđể ngăn ngừa sự hủy diệt chủng loại bởi thiết yếu những enzyme có trong mẫu mã. Nên tiến hành chuẩn bị tế bào làm việc nhiệt độ thấp nhằm rời hiện tại tượngđổi mới tính proteinvà suy giảm (mất chức năng).

Păn năn phù hợp kỹ thuật hóa sinc và cơ học – bao hàm nhiều phương thức thanh lọc vàly tâm– hoàn toàn có thể được áp dụng nhằm phân tách bóc các nguyên tố tế bào cùng cácbào quankhông giống nhau

Điện di trên gel

Điện di trên gelnhằm phân tách những protein vào mẫu mã. Sự phân bóc này của protein dựa trênđiểm đẳng điện(pI),khối lượng phân tử, điện tích, hoặc kết hợp những nguyên tố trên. đặc điểm (bạn dạng chất) của quy trình phân tách bóc nhờ vào vào cách cách xử lý mẫu mã và Đặc điểm của bản gel. Đây là một trong bí quyết cực kỳ hữu ích (hiệu quả) để khẳng định protein.

Tính đến nay, phương pháp điện di được áp dụng phổ cập độc nhất là điện di trên gelpolyacrylamidevà có bổ sungsodium dodecyl sulfate(SDS). Phương thơm phápSDS-PAGE(năng lượng điện di bên trên gel polyacrylamidetất cả bổ sung cập nhật SDS) giữ các polypeptide sinh hoạt tâm trạng thay đổi tính sau khoản thời gian bọn chúng được giải pháp xử lý với chất khử táo bạo với không đủ cấu tạo bậc nhì, cấu trúc bậc 3 (ví dụ, cầu disulfide làm cho những team sulfhydryl ) cùng vì thế cácprotein đượcphân táchdựa vào khối lượng phân tử. Protein trong chủng loại mang điện tích âm vì chưng SDS sẽdịch chuyển cho tới rất dương trải qua mạngacrylamidecủa bạn dạng gel (di chuyển hẳn sang mạng lưới acrylamide tới cực dương). Các protein bé dại rộng dịch chuyển nkhô nóng hơn qua màng cùng vì vậy chúng được phân tách theo cân nặng (thường sử dụng đơn vị kilodaltons,kDa). Nồng độ acrylamide xác định tài năng phân tách của gel – độ đậm đặc càng tốt thì phân bóc càng tốt những protein bao gồm khối lượng phân tử bé dại. Nồng độ acrylamide càng thấp, thì phân tách càng tốt hơn các protein tất cả khối lượng phân tử lớn hơn. Protein dịch rời theo 1 phía dọc phiên bản gel vào phần lớn các màng lai. (Tìm phát âm thêm về phương thức SDS- PAGE tại đây).

Các mẫu được hấp thụ vào trong các giếng của phiên bản gel. Thường vướng lại một giếng nhằm chochỉ thị (marker) hoặc thang chuẩn (ladder), là một trong sản phẩm thương mại gồm đựng hỗn hợp các protein cùng với cân nặng phân tử khẳng định, được nhuộm nhằm có thể tạo nên băng màu sắc cùng thấy được được. Khiđiện thếđược tùy chỉnh thiết lập bên trên gel, protein bắt đầu dịch chuyển với những tốc độ khác biệt phụ thuộc vào vào cân nặng phân tử của bọn chúng. Vận tốc dịch rời khác biệt của những protein (sự khác hoàn toàn vềđộ di động cầm tay điện di) sẽ tạo nên thành vén không giống nhau trên mỗi giếng.

Cũng hoàn toàn có thể thực hiện gel hai phía (two-dimensional (2-D) gel) để phân bóc protein xuất phát điểm từ một mẫu mã tuyệt nhất theo hai chiều. Theo chiều đầu tiên, protein được phân bóc dựa trên điểm đẳng năng lượng điện (pH tại đó protein có điện tíchtrung tính), với chiều thiết bị hai theo cân nặng phân tử của protein.

Chuyển lên màng lai

Đểprotein có thể link được cùng với các chống thể sệt hiệu, gel đề nghị được chuyểnlên màngnitrocellulosehaypolyvinylidene difluoride(PVDF). Phương pháp chủ yếu nhằm đưa các protein được Điện thoại tư vấn là pmùi hương phápthđộ ẩm tách điệnvà sử dụng một mẫu năng lượng điện nhằm kéo những protein tự gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocelluthua thảm. Các protein được di chuyển từ gel lên màng mà vẫn duy trì sự sắp xếp nhỏng bên trên bản gel. Một phương thức không giống (cũ) trong sự dịch chuyển protein bao gồm câu hỏi đặt màng lên trên mặt bạn dạng gel, rồi đặt tiếp một tấm giấy lọc lên trên. Đặt giấy lọc cả vào hỗn hợp đệm, hỗn hợp đệm có thể thấm dần lên giấy thanh lọc bằnglực mao dẫn, với mang theo cả protein. Trên thực tế, cách thức này sẽ không được áp dụng vày tốn những thời gian, thẩm bóc tách điện thường xuyên được áp dụng nhiều hơn.

Kết trái của 1 trong những hai quá trình “lai thấm” (thđộ ẩm tách bóc miễn dịch) là protein sẽ được ptương đối ra bên trên lớp mặt phẳng (bềmặt lớp mỏng) để tiến hành phân phát hiện(sẽ được trình bày mặt dưới). Cả hai một số loại màng được lựa chọn vì công năng liên kết không đặc hiệu cùng với protein (ví dụ, năng lực link với tất cả những protein là đương đương). Liên kết protein dựa vào cửa hàng kị nước, cũng như cửa hàng năng lượng điện giữa màng và protein. Màng nitrocelluthua kém tốt rộng màng PVDF, tuy nhiên mỏng tanh rộng với không bền trường hợp tái áp dụng.

cũng có thể bình chọn sự đồng bộ và kết quả ở đầu cuối của quy trình chuyển protein từ gel lên màng bằng cách nhuộm màng với chất nhuộmCoomassie Brilliant BluehoặcPonceau S. Ponceau S hay được áp dụng nhiều hơn thế nữa bởi nó tất cả độ tinh tế cao và tính rã trong nước, tạo nên hóa học nhuộm dễ dẫn đến rửa trôi và dò màng nhỏng sẽ được biểu lộ ở chỗ sau.

Blocking

Từ lúc màng được lựa chọn có công dụng liên kết cùng với protein, cả chống thể và protein đích phần đông là protein, nên đề nghị triển khai quá trình nhằm ngăn ngừa link thân màng và kháng thể được áp dụng để chứng thực protein kim chỉ nam. Ngăn chặn những links không đặc hiệu bằng cách đặt màng vào hỗn hợp protein loãng- nổi bật làalbumin huyết tương bò3-5% (BSA) hoặcsữa gầy(cả hai đều có Chi phí thấp) trongTris-Buffered Saline(TBS) hoặc I-Bloông xã, cùng với Xác Suất hóa học tẩy rửa nhỏ(0.1%) nhưTween 20hoặcTriton X-100. Protein trong hỗn hợp loãng đang khóa toàn bộ các vị trí nhưng protein đích chưa gắntrên màng. Do kia, Lúc bổ sung cập nhật phòng thể, nó sẽ không còn thể đính thêm không đặc hiệu quanh đó việc đính thêm với protein đích. Vấn đề này làm giảm cơ bạn dạng sự nhiễuvào quátrìnhWestern Blot, mang lại hiệu quả ví dụ với thải trừ hiện tượng lạ dương tính giả.

Sự phân phát hiện

Trong quy trình phát hiện tại, màngcó chức năng liên kết với enzyme thông báo; enzyme này Khi chức năng với một cơ hóa học khớp ứng, đã liên can phản bội ứng phátquang quẻ cùng tạo nên màu. Vì các ngulặng nhân, điều đó thường ra mắt trong một quá trình có nhị bước, tuy vậy hiện nay cách thức phân phát hiện tại một bước vẫn được vận dụng đến rất nhiều vận dụng một mực.

Hai bước

Kháng thể sơ cấp được tạo ra lúc mang đến trang bị nhà tốt canh trường tế bào miễn dịch (môi trường thiên nhiên nuôi ghép tế bào miễn dịch) tiếp xúc với protein quyên tâm (hoặc một trong những phần của nó). Thông thường, đấy là một phần vào đáp ứng miễn dịch, kháng thể thu nhấn cùng áp dụng như một chế độ xác định quánh hiệu cơ mà rất có thể liên kết trực tiếp cùng với protein.

Xem thêm: Dân Mạng Soi Ra "Ẩn Tình" Vụ Song Hye Kyo For Elle China June 2016 ?

Sau khi bủa vây (blocking), ủ dung dịch loãng của kháng thể sơ cấp (hay sử dụng nồng độ giữa 0.5 với 5 micrograms/mL) cùng với màng và rung lắc thanh thanh. Đôi khi, dung dịch này bao gồm hỗn hợp muối hạt đệm với 1 lượng bé dại chất tẩy rửa và thỉnh phảng phất cũng có thể có thêm sữa bột hoặc BSA. Dung dịch phòng thể cùng màng rất có thể được duy trì cùng ủ lại cùng nhau ở và một nơi trong khoảng 1/2 tiếng cho tới qua tối. Cũng hoàn toàn có thể được ủ nghỉ ngơi các ánh nắng mặt trời khác nhau, với ánh nắng mặt trời càng tốt càng kích ham mê links, cả liên kết quánh hiệu (so với protein đích, “tín hiệu”) và protein ko quánh hiệu (“nhiễu”).

Sau Khi rửa màng nhằm loại trừ phòng thể sơ cung cấp chưa liên kết, màng liên tục được đính kháng thể thiết bị nhị (thứ cấp), được dính trực tiếp vào phần sệt hiệu theo loại của kháng thể sơ cung cấp. Các chống thể bao gồm xuất phát động vật (hoặc canh trường hybridoma nguồn gốc đụng vật); chống chuột vật dụng cung cấp sẽ links cùng với phần đông các chống thể sơ cấp ngẫu nhiên làm sao tất cả xuất phát trường đoản cú chuột, điều đó được cho phép tiết kiệm ngân sách và chi phí chi phí mang lại toàn thể phòng thử nghiệm vì chưng cso thể sử dụng chung một mối cung cấp chống thể trong tiếp tế chống thể 1 loạt, và cung cấp tác dụng bất biến theo thời gian. Kháng thể này được biết đến như thể kháng thể vật dụng cấp, với do đó nó có điểm lưu ý hướng đích, gồm xu hướng được Điện thoại tư vấn là “kháng- chuột” “kháng-dê,” vv. Kháng thể máy cấp thường xuyên được links vớibiotinhoặcenzymethông tư nhưalkaline phosphatasehayhorseradish peroxidase. Vấn đề này Có nghĩa là những kháng thể máy cung cấp vẫn links với một phòng thể sơ cấp với khuếch đại biểu lộ.

Phổ trở nên độc nhất vô nhị là thực hiện chống thể trang bị cung cấp gắnhorseradish peroxidaseđể bóc tác nhân phát quang đãng hóa học, và sản phẩm bội nghịch ứng phân phát rahuỳnh quangXác Suất cùng với lượng protein. Một tấm film gồm độ tinh tế cao của film tự sướng được đặt vào màng, với xúc tiếp cùng với ánh sáng từ phản bội ứng tạo thành hình họa của kháng thể links lai (blot). Chi phí của phương thức này tốt hơn mặc dù không nhiều nhạy bén rộng lúc thực hiện phương pháp nhuộm4-chloronaphtholvới 1%hydroren peroxide; phản ứng của các gốc peroxide cùng với 4-chloronaphthol tạo thành một vệt tím sẫm có thể chụp được ảnh mà lại ko đề xuất thực hiện film chụp ảnh chuyên được sự dụng.

Như với quy trìnhELISPOTvàELISA, enzyme bội phản ứng cùng với cơ hóa học của một phân tử sẽ được biến đổi tạo sản phẩm làm phản ứng chế tạo màu rất có thể vạc hiện tại bên trên màng (quan tiền gần cạnh hình bên với các dải color xanh).

Một phương pháp khác nhằm phạt hiện nay kháng thể trang bị cung cấp thực hiện phản xạ hồng ngoại (NIR) sát links cùng với kháng thể đính thêm hóa học huỳnh quang đãng. Ánh sáng huỳnh quang quẻ ko đổi khác được tạo thành từ bỏ sự kích thích hợp của những hóa học nhuộm huỳnh quang đãng, tạo nên sự phân phát hiện huỳnh quang đãng đúng mực hơn cùng là thước đo đúng đắn cho sự khác nhau trong bộc lộ được tạo nên bươi những kháng thể được lưu lại links với những protein trong cách thức Western Blot. Có thể định lượng protein một biện pháp đúng chuẩn bởi các bộc lộ được tạo thành bởi lượng protein không giống nhau trên màng được đo vào tinh thần tĩnh, khi so sánh với việc phân phát quang quẻ hóa học, trong số ấy ánh sáng được đo trong tinh thần đụng.

Phương thơm pháp thiết bị cha là sử dụng đánh dấu pđợi xạ chũm vì chưng enzyme kèm theo cùng với kháng thể trang bị cung cấp, nlỗi thêm một protein liên kết phòng thể nlỗi Protein A củaStaphylococcusxuất xắc Streptavidin cùng với hóa học đồng vị pđợi xạ iot. Kể tự khi những phương pháp không giống an ninh hơn, nkhô giòn hơn cùng giá rẻ hơn Thành lập, phương thức này hiện giờ siêu ít được sử dụng; tuy vậy, một lợi thế của phương thức này là độ nhạy bén của chuyên môn chụp ảnh pngóng xạ- tự động hóa, chất nhận được định lượng protein cùng với độ đúng mực cao Lúc kết hợp với ứng dụng quang đãng học (vd. Optiquant).

Một bước

Trong lịch sử vẻ vang, quy trình dò được tiến hành theo nhị bước vì chưng tạo ra phòng thể sơ cấp và phòng thể lắp thêm cung cấp trong những quy trình hiếm hoi là tương đối dễ dàng. Như vậy đem lại đến nghiên cứu viên cùng các tổ chức triển khai nghiên cứu phần đông lợi thế rất to lớn nhỏng năng động cùng bổ sung cập nhật bước khuếch tán trong quá trình vạc hiện tại. Với sự Thành lập và hoạt động của so với protein hiệu năng cao với giới hạn phải chăng của sự phân phát hiện, tuy vậy, tín đồ ta vẫn quan tâm tới sự việc trở nên tân tiến hệ thống dò tìm một bước cơ mà cho phép quá trình ra mắt nkhô giòn hơn và ít tốn kém nhẹm rộng. Điều này phải cho tới phòng thể dò vừa có khả năng nhận ra protein quyên tâm vừa chứa đựng nhãn hoàn toàn có thể xác định, đầu dò hay được biết đến như làđuôi protein. Ủ đầu dò sơ cấp với màng Theo phong cách giống như nlỗi cùng với chống thể sơ cấp cho vào quá trình nhì bước, sau đó chuẩn bị để xác định trực tiếp sau khoản thời gian cọ những lần.

Phương thơm pháp Western Blot áp dụng hệ thống phát hiện tại phóng xạ.

Sự phát hiện / Sự hiển thị

Sau Khi cọ những đầu dò ko gắn lên màng, màng lai đó đã chuẩn bị sẵn sàng vạc hiện đầu dò đang lưu lại với links cùng với protein quan tâm. Trong thực tiễn, chưa phải toàn bộ đa số biểu hiện protein chỉ trên một băng trên màng. Khối hận lượng giao động được khẳng định bằng phương pháp so sánh những băng nhuộm cùng với các chỉ thị hoặc thang chuẩn Khi điện di. Quá trình cũng thường được triển khai đối với protein cấu trúc, như actin xuất xắc tubulin, cơ mà protein dạng này tránh việc biến đổi thân các mẫu. Lượng protein phương châm được định nấc đối với các protein cấu tạo để kiểm soát và điều hành thân những đội. Một giải pháp xuất sắc rộng là sự định mức tổng cộng protein được hiển thị cùng với trichloroethanolhayepicocconone.Vấn đề này thực tiễn bảo đảm kiểm soát và điều chỉnh tổng thể protein ở màng trong ngôi trường thích hợp có không đúng sót hoặc quy trình gửi lên màng ko được hoàn thiện.

Xác định màu

Pmùi hương pháp xác định màu sắc dựa vào vào quy trình ủ của Western Blot cùng với cơ chất làm phản ứng với enzyme để thông tư (nhưperoxidase) mà lại liên kết cùng với kháng thể sản phẩm cung cấp. Nó vẫn đổi khác những dung dịch nhuộm hòa hợp này thành dạng ko chảy của color khác kết tủa tức thì trên vị trí enzyme đính thêm cùng cho nên vì vậy có tác dụng màng hiện nay color. Quá trình hiện nay color dừng lại sau thời điểm cọ hóa học nhuộm rã. Đánh giá cường độ thể hiện của protein thông quamật độ kế(nhuộm đậm đến mức nào) hayquang quẻ phổ kế.

Xác định sự vạc quang quẻ hóa học

Pmùi hương pháp xác minh sựvạc quang đãng hóa họcdựa vào vào quy trình ủ của Western Blot cùng với cơ chất phân phát quang đãng Khi được tiếp xúc cùng với chất thông tư đính thêm trên kháng thể sản phẩm công nghệ cung cấp. Ánh sáng phạt ra chiếm được bằng máy chụp CCD cơ mà có thể bắt được hình họa tiên tiến nhất của màng lai hoặc bởi phyên hình họa. Pmùi hương pháp sử dụng phim để phát hiện tại màng lnhiều người đang từ từ biến mất vì sự phi đường tính của hình ảnh (định lượng không chủ yếu xác). Tấm hình được so với bởi mật độ kế, đo lượng tương đối protein nhuộm và định lượng tác dụng theo tỷ lệ quang quẻ. Phần mượt bắt đầu có thể chấp nhận được phân tích nhiều hơn các dữ liêụ như cân nặng phân tử giả dụ như thực hiện đúng một số loại chất. Các công ty lớn thường cung ứng hệ thống hình ảnh Phát quang đãng hóa học Analytik Jemãng cầu, Syngen, UVPhường., Azure Biosystems, UVITEC, GE với Biorad.

Xác định phóng xạ

Phương pháp đánh dấu chống xạ không đề nghị cơ hóa học enzyme, mà lại không những thế, phải để film X-quang trực tiếp trước màng lai, nhưng được cải cách và phát triển như thể pkhá nó lên vệt phóng xạ cùng tạo thành vùng buổi tối tương tứng với băng protein quan tâm (quan tiền gần kề hình hình họa mặt phải). Tầm quan trọng của cách thức khắc ghi pđợi xạ vẫn giảm dần dần bởi sự nguy nan của pngóng xạ, ngân sách cao, tác động bự mang lại sức mạnh và sự an toàn của người tiêu dùng, cùng thường được sửa chữa thay thế bằng ECL (tăng cường vạc quang hóa học) là 1 trong sự chọn lọc hữu ích.

Xác định huỳnh quang

Đầu dò ghi lại huỳnh quang đãng được kích yêu thích bằng ánh nắng cùng xác minh tia nắng phát ra bằng cảm ứng quang tự động chụp CCD được máy cỗ thanh lọc ánh sáng khớp ứng mà thu được hình ảnh kỹ thuật số của màng lai cùng rất có thể tiến hành so sánh hơn nữa về cân nặng phân tử và so sánh định lượng trên màng lai. Pmùi hương pháp khắc ghi huỳnh quang được xem như xét như thể phương thức rất tốt nhằm định lượng tuy nhiên độ nhạy cảm kỉm rộng phương thức phát quang hóa học.

Dò trang bị cấp

Một sự khác biệt lớn giữa màng nitrocelluthua kém và màng PVDF liên quan đến năng lực cung cấp “việc tách” một số loại những kháng thể và tái sử dụng màng đến chống thể đầu dò tiếp theo sau. Trong lúc có nhiều quá trình tốt tùy chỉnh thiết lập để tách bóc các loại kháng thể bên trên màng nitrocelluthất bại, sự chắc chắn hơn của màng PVDF cho phép sự tách bóc một số loại thuận lợi rộng, và tái sử dụng được không ít hơn trước khi nghiên cứu bị giới hạn do sự nhiễu trên nền. Một điểm khác hoàn toàn nữa là không hệt như màng nitrocelluthua thảm, màng PVDF đề nghị được nhấp lên xuống trong ethanol 95%, isopropanol xuất xắc methanol trước lúc sử dụng. Màng PVDF thông thường sẽ có Xu thế dày dặn hơn với tài năng hạn chế lại những nhân tố tổn hại cao hơn trong quy trình sử dụng.

Điện di trên gel 2-D

Phương thơm pháp năng lượng điện di SDS-PAGE 2- chiều sử dụng các hiệ tượng và chuyên môn trình diễn nghỉ ngơi trên. Nhỏng tên thường gọi phương thức năng lượng điện di SDS-PAGE 2- chiều, tương quan tới sự việc dịch rời của các polypeptides theo 2 chiều. Thí dụ, theo chiều đầu tiên, các polypeptide sẽ được phân bóc dựa trênđiểm đẳng điện, trong những lúc theo chiều đồ vật nhị, các polypeptide được phân tách dựa theotrọng lượng phân tửcủa bọn chúng. Điểm đẳng năng lượng điện của protein cố định được khẳng định vì chưng số lượng kha khá các amino acid tích điện dương (thí dụ. lysine, arginine) cùng những amino acid tích điện âm (thí dụ. glytamate, aspartate), cùng với các amino acid tích điện âm góp phần tạo nên điểm đẳng năng lượng điện phải chăng và các amino acid tích năng lượng điện dương góp thêm phần tích cực khiến cho điểm đẳng năng lượng điện cao. Các chủng loại cũng hoàn toàn có thể được phân tách trước tiên trong ĐK không rút ít gọn thực hiện SDS- PAGE với bên dưới điều kiện rút ít gọn nghỉ ngơi chiều trang bị nhị, có tác dụng bóc tránh link disulfide nhưng mà có vai trò giữ lại những tè đơn vị cùng nhau. SDS-PAGE cũng rất có thể kết phù hợp với ure – PAGE tạo cho một gel hai chiều.

Về cơ chế, phương pháp này được cho phép phân tách tất cả những protein tế bào trên một gel mập độc nhất. Một ưu cố gắng phệ của phương thức này là nó thường rành mạch sự không giống nhaugiữa các đồng dạng của một một số loại protein riêng biệt biệt- thí dụ một protein đã có phosphoryl hóa (bằng phương pháp bổ sung cập nhật team tích năng lượng điện âm). Protein đã được phân tách ra có thể được cắt thoát ra khỏi gel và kế tiếp được phân tích bởi pmùi hương phápquang phổ khốiđể xác định potein.